Proteae tahan panas kebanyakan dipalikasikan untuk menghasilkan peptide berberat molekul tinggi dan untuk memecah hard-to-degrade protein seperti collagen, keratin dan prion protein. Pertumbuhan pasar dan aplikasinya yang potensial telah mendorong usaha untuk menemukan enzim tahan panas yang umumnya dihasilkan oleh thermophile. Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk memperoleh protease tahan panas dari strain LII dan mempelajari sifat-sifat protease yang telah dimurnikan. Tujuan khusus penelitian ini adalah: 1) untuk menguji kemampuan strain LII yang diisolasi dari sumber air panas Padangcermin, Lampung dalam menghasilkan protease tahan panas dengan cara menentukan suhu optimum dan kestabilan terhadap panas dari enzim kasar, 2) untuk menentukan pengaruh pH media, suhu inkubasi dan jenis substrat terhadap produksi protease tahan panas oleh strain LII dan 3) untuk menentukan adanya sifat-sifat baru dengan cara memurnikan dan mengkarakterisasi enzim tahan panas yang dihasilkan oleh strain LII. Strain LII ditumbuhakan pada media cair Minimal Synthetic Medium (MSM: 0,1% NaCl, 0,1% K2HPO4, 0,7% (NH4)2SO4, 0,01% MgSO4.7H2O, 0,05% ekstrak khamir dengan 1% susu skim) selama 24 jam dan enzim kasarnya dikarakterisasi sebagian. Identifikasi strain LII dilakukan dengan sekuen gen16S rRNA. Optimasi produksi dilakukan dengan menentukan pH optimum media, suhu optimum inkubasi dan substrat yang tepat untuk produksi enzim. Pemurnian protease dilakukan dalam 3 langkah yaitu ultra filtration, ion exchange dan gel filtration. Hasil menunjukkan bahwa enzim kasar yang dihasilkan oleh strain LII mempunyai pH optimum 9, suhu optimum 85oC dan stabil selama 100 menit pada suhu 75oC. Strain LII mempunyai 99% kesamaan dengan Brevibacillus thermoruber. Brevibacillus sp. LII menghasilkan protease tahan panas dengan optimal pada pH media 6, suhu inkubasi 50oC dengan keratin sebagai substrat setelah 22 jam pembiakan. Aktivitas keratinolitik protease yang dihasilkan oleh Brevibacillus sp. LII ditunjukkan dengan mendegradasi bulu ayam utuh setelah pembiakan 24 jam dalam MSM cair. Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa enzim murni yang diperoleh dari Brevibacillus sp. LII mempunyai berat molekul 36 kDa dan native 215 kDa. Protease LII merupakan homomer karena pita tunggal yang terlihat pada gel SDS PAGE dan diperkirakan terdiri dari 6 (enam) sub unit atau hexameric. Protease murni dari Brevibacillus sp. LII dipastikan merupakan keratinolitic thermostable neutral metalo serine protease karena beberapa sifatnya yang antara lain dihambat secara keseluruhan oleh PMSF dan EDTA dan menunjukkan aktivitas optimum pada pH 8 dan lebih aktif pada kondisi asam. Protease ini menunjukkan sifat yang unik ketika diinkubasi dengan 2,5 mM ion logam dimana semua ion logam yang diujikan kecuali Li2+ meningkatkan aktivitas enzim. Peningkatan aktivitas paling tinggi ditunjukkan dengan penambahan Ca2+ yaitu sebesar 250%. Protease LII mempunyai suhu optimum 60oC tanpa penambahan CaCl2 dan 80 – 85oC dengan 2,5 mM CaCl2. Enzim juga menunjukkan kestabilan terhadap keberadaan pelarut organik. Hasil Perhitungan terhadap parameter kinetik menunjukkan bahwa protease ini mempunyai nilai KM yang jauh lebih tinggi dari nilai KM protease yang pernah dilaporkan (KM = 27,2 mg/ml atau 0,362 – 0,272 M, substrat x Hammerstein Casein :MM 75–10 kDa; Vmax= 261,1 μg/menit/ml). Sifat-sifat baru yang mungkin dimiliki oleh protease yang dihasilkan Brevibacillus sp. LII adalah diperkirakan merupakan homomer hexameric, aktivitas ditingkatkan oleh sebagian besar ion logam dan nilai KM yang tinggi.

Thermostable proteases are applied mostly in the production of high molecular weight peptides and degradation of hard-to-degrade protein such as collagen, keratin and prion protein. The growing market and the potential application have prompted the effort to obtain thermostable protease which is produced mostly by thermophile. The general aim of this research were to obtain thermostable protease from strain LII which was isolated from Padangcermin, Lampung and to study the characteristics of the purified enzyme. The specific aims were 1) to confirm the capability of strain LII to produce thermostable protease by determining optimum temperature and the stability against thermal of crude enzyme, 2) to determine the effect of incubation temperature, medium pH and kind of substrate on enzyme production by strain LII and 3) to determine the new characteristics by purification and characterization of thermostable protease produced by strain LII. Strain LII was grew in liquid Minimal Synthetic Medium (MSM) with 1.5% skim milk and the crude enzyme was partially characterized. Identification of strain LII was carried out using sequence of 16S rRNA gene. The optimum condition was obtained by determining the optimum of medium pH, incubation temperature and the proper substrate for enzyme production. Protease purification was carried out in 3 steps (ultra filtration, ion exchange and gel filtration) and the purified protease was characterized. The result showed that strain LII produced crude thermostable protease with optimum pH of 9, optimum temperature of 85oC and stable for up to 100 minutes at 75oC. Strain LII was identified as Brevibacillus thermoruber with 99% similarity. The protease was produced optimally at 50oC, medium pH of 6 and keratin as substrate after 22 hours cultivation. It was predicted that the pure enzyme obtained from Brevibacillus sp. LII had molecular weight of 36 kDa and its native was 215 kDa. Purified protease LII was homomer since the denaturized enzyme showed the single band so that the molecule was predicted consisting about six subunits or hexameric. The purified protease LII was confirmed as keratinolitic thermostable neutral metalo serine protease based on its characteristics which was inhibited by PMSF and EDTA and showed optimum activity at pH of 8 and more active in acidic condition. The unique characteristic of purified protease LII was all of metal ions but Li2+ which were tested enhancing the enzyme activity. The highest effect was shown by Ca2+ which enhancing the activity up to 250%. The purified protease LII had optimum temperature at 60oC without CaCl2 and 80 – 85oC with 2.5 mM CaCl2. The protease also showed the stability against solvent. The KM and Vmax values for purified protease LII were 27.2 mg/ml or 0.362 – 0.272 M for its substrate Hammerstein Casein (MM 75–100 kDa) and 261.1 μg/minute/ml respectively. The new characteristics of purified protease LII possibly were predicted as homomer hexameric, the activity was enhanced by most of metal ions and high KM value.

Kata Kunci : sumber air panas, protease tahan panas, Brevibacillus sp.